En préparation du Grand Prix d’Italie à Mugello, Jorge Martin, le leader actuel du championnat MotoGP, a obtenu la pole position. Cet accomplissement est devenu encore plus significatif lorsque Marc Marquez, un concurrent redoutable, a chuté lors de son tour qui aurait pu battre le temps de Martin. Marquez a d’abord établi un temps respectable en suivant Pedro Acosta, mais s’est retrouvé dans une position désavantageuse lors de sa deuxième tentative. Cependant, il a effectué un mouvement audacieux pour dépasser Miguel Oliveira et a essayé de rattraper Franco Morbidelli pour avoir une référence pour le reste du tour. Malheureusement, Marquez a chuté à Scarperia, mettant fin à ses chances de sécuriser la pole position. Le temps initial de Martin de 1m44.504s était suffisant pour obtenir la pole position, malgré qu’il n’ait pas amélioré son temps lors de sa deuxième tentative.
Pecco Bagnaia, le champion en titre, n’a également pas réussi à améliorer son temps lors de sa deuxième tentative et partira de la cinquième place en raison d’une pénalité de trois positions sur la grille pour avoir obstrué Alex Marquez lors de la séance de vendredi. Cependant, Bagnaia partira toujours deuxième lors de la course sprint, car la pénalité ne s’applique qu’à la course de pleine longueur. Maverick Vinales, roulant pour Aprilia, a obtenu le troisième meilleur temps en suivant de près Bagnaia lors de sa première tentative. Bien qu’il ait menacé d’améliorer son temps vers la fin, il a fini par se contenter d’un temps légèrement plus lent qui le placerait tout de même sur la première ligne.
Marc Marquez, malgré sa chute, partira du Grand Prix d’Italie en troisième position, derrière Martin et Vinales, et devant Bagnaia. Enea Bastianini, le coéquipier de Bagnaia, a sécurisé la cinquième place, tandis que Franco Morbidelli, qui avait déjà battu le record du tour en Q1, a terminé sixième. Pedro Acosta, le seul pilote KTM/Gas Gas RC16 en Q2, a terminé septième. Le jeune Marquez et Aleix Espargaro d’Aprilia compléteront la troisième ligne.
Alex Rins, à la tête de l’équipe Yamaha, a sécurisé la dixième position, suivi par Miguel Oliveira et Raul Fernandez de Trackhouse Aprilia. Fernandez aurait été sur la deuxième ligne s’il avait égalé sa performance en Q1. Une chute du pilote invité Pol Espargaro a provoqué des drapeaux jaunes, affectant les chances de Fabio Di Giannantonio de passer en Q2. Di Giannantonio a terminé 14e sur la grille.
Fabio Quartararo, pilotant la deuxième Yamaha, partira de la 15e place, ratant de peu une place en Q2 malgré l’amélioration des performances de Yamaha et son propre rythme de course solide. Marco Bezzecchi, le coéquipier de Quartararo dans l’équipe VR46, a terminé 16e, suivi par Joan Mir en tant que meilleur pilote Honda. Mir a bénéficié d’un sillage opportun de Quartararo, mettant fin à la série de Johann Zarco en tant que meilleur pilote Honda depuis l’arrivée de Zarco.
Jack Miller a connu une performance décevante, terminant 19e sur la deuxième KTM officielle. Il a été suivi de près par Augusto Fernandez de Tech3 Gas Gas et le pilote invité Espargaro, malgré la chute de ce dernier.
