En la sesión de práctica libre inaugural del fin de semana del Gran Premio de Italia en Mugello, Maverick Vinales, piloto de Aprilia MotoGP, tomó la delantera. Vinales tuvo dificultades en la reunión del fin de semana anterior en Barcelona, con bajo agarre, luchando con la falta de sensación en el neumático delantero y siendo superado por su compañero de equipo Aleix Espargaro. Sin embargo, mostró un regreso temprano a la forma en el circuito de alto agarre de Mugello. Su tiempo de vuelta de 1m46.140s lo colocó dos décimas por delante de Fabio Quartararo de Yamaha. Las M1 parecían competitivas durante la sesión de 45 minutos, especialmente después de las pruebas en Mugello a principios de este mes.
Franco Morbidelli, ex compañero de equipo de Quartararo en Yamaha, terminó tercero como el mejor piloto de Ducati. Pedro Acosta de Tech3 Gas Gas logró asegurar la cuarta posición, a pesar de una caída tardía en Scarperia. Jorge Martin del equipo Pramac de Morbidelli llegó en quinto lugar, seguido por Marc Marquez, su rival por un puesto en el equipo oficial de Ducati. Marquez, montando una Ducati de hace un año para Gresini, decidió no cambiar sus neumáticos durante la sesión, finalizando en sexto lugar, poco más de cuatro décimas detrás del líder.
Pecco Bagnaia, el actual campeón de Ducati, se encontró en una situación similar, manteniendo el mismo juego de neumáticos y terminando en noveno lugar. Desafortunadamente, su mejor tiempo de vuelta fue excluido después de la sesión, lo que le habría asegurado el octavo lugar. En su lugar, Alex Rins de Yamaha ocupó la octava posición, seguido por Aleix Espargaro de Aprilia, quien tuvo dos excursiones a la grava en la Curva 1 (San Donato).
A pesar de mantener el mismo juego de neumáticos, Alex Marquez de Gresini Ducati y Raul Fernandez de Trackhouse Aprilia obtuvieron resultados decentes, completando el top 11. Pol Espargaro, un piloto invitado de KTM, comenzó su primer fin de semana de MotoGP desde finales de 2023 y terminó en 15º lugar. Luca Marini fue el piloto de Honda mejor clasificado en 19º lugar, con el fabricante japonés también realizando pruebas.
