En preparación para el Gran Premio de Italia en Mugello, Jorge Martin, el actual líder del campeonato de MotoGP, aseguró la pole position. Este logro se volvió aún más significativo ya que Marc Marquez, un fuerte competidor, se estrelló durante su vuelta que tenía el potencial de superar el tiempo de Martin. Marquez inicialmente estableció un tiempo respetable mientras seguía a Pedro Acosta, pero se encontró en una posición desventajosa en su segundo intento. Sin embargo, hizo un movimiento audaz para adelantar a Miguel Oliveira y trató de alcanzar a Franco Morbidelli para tener una referencia para el resto de la vuelta. Desafortunadamente, Marquez se estrelló en Scarperia, poniendo fin a sus posibilidades de asegurar la pole position. El tiempo de vuelta inicial de Martin de 1m44.504s fue suficiente para asegurar la pole position, a pesar de no mejorar en su segundo intento.
Pecco Bagnaia, el campeón reinante, también no logró mejorar en su segundo intento y comenzará la carrera en quinto lugar debido a una penalización de tres posiciones en la parrilla por obstruir a Alex Marquez durante la sesión del viernes. Sin embargo, Bagnaia aún comenzará segundo en la carrera sprint, ya que la penalización solo se aplica a la carrera de larga duración. Maverick Vinales, que compite para Aprilia, aseguró el tercer mejor tiempo al seguir de cerca a Bagnaia en su primer intento. Aunque amenazó con mejorar su tiempo hacia el final, terminó conformándose con un tiempo ligeramente más lento que aún lo colocaría en la primera fila.
Marc Marquez, a pesar de su accidente, comenzará el Gran Premio de Italia en tercer lugar, detrás de Martin y Vinales, y por delante de Bagnaia. Enea Bastianini, compañero de equipo de Bagnaia, aseguró el quinto lugar, mientras que Franco Morbidelli, quien ya había roto el récord de vuelta en Q1, terminó en sexto. Pedro Acosta, el único piloto de KTM/Gas Gas RC16 en Q2, terminó séptimo. El joven Marquez y Aleix Espargaro de Aprilia completarán la tercera fila.
Alex Rins, liderando el equipo Yamaha, aseguró la décima posición, seguido por Miguel Oliveira y Raul Fernandez de Trackhouse Aprilia. Fernandez habría estado en la segunda fila si hubiera igualado su rendimiento en Q1. Una caída del piloto invitado Pol Espargaro provocó banderas amarillas, afectando las posibilidades de Fabio Di Giannantonio de avanzar a Q2. Di Giannantonio terminó 14º en la parrilla.
Fabio Quartararo, pilotando la segunda Yamaha, comenzará en 15ª posición, quedándose muy cerca de un lugar en Q2 a pesar de la mejorada actuación de Yamaha y su propio fuerte ritmo de carrera. Marco Bezzecchi, compañero de equipo de Quartararo en el equipo VR46, terminó 16º, seguido por Joan Mir como el mejor piloto de Honda. Mir recibió un oportuno rebufo de Quartararo, poniendo fin a la racha de Johann Zarco como el mejor piloto de Honda desde la llegada de Zarco.
Jack Miller tuvo una actuación decepcionante, finalizando 19º en la segunda KTM oficial. Fue seguido de cerca por Augusto Fernandez de Tech3 Gas Gas y el piloto invitado Espargaro, a pesar de la caída de este último.
