Francesco Bagnaia, el actual campeón de MotoGP, terminó primero en la sesión de entrenamiento del viernes en Mugello, con Alex Rins de Yamaha en segundo lugar. El tiempo de vuelta de Bagnaia de 1m44.938s fue más de un cuarto de segundo más rápido que el resto del grupo, justo un poco por debajo del nuevo récord de pista. Sin embargo, Bagnaia está actualmente bajo investigación por obstruir a Alex Marquez durante la sesión. A pesar de esto, el fuerte rendimiento de Yamaha en Mugello continuó, con Rins mostrando su velocidad y el novato Pedro Acosta asegurando un lugar en Q2. La caída anterior de Acosta no obstaculizó su progreso. Brad Binder de KTM también tuvo un tiempo de vuelta prometedor, pero fue excluido debido a límites de pista. Miguel Oliveira de Trackhouse Aprilia tuvo su mejor actuación de la temporada hasta ahora, terminando en cuarto lugar. Marc Marquez de Gresini Ducati logró evitar la eliminación de Q1 con el quinto tiempo más rápido. Otras actuaciones notables vinieron de Enea Bastianini, Jorge Martin y Alex Marquez, todos montando Ducatis. Maverick Vinales y Aleix Espargaro aseguraron los últimos lugares en Q2 con sus Aprilias. Fabio Quartararo de Yamaha terminó un cuarto de segundo detrás de Rins, evitando por poco participar en Q1. Takaaki Nakagami de Honda tuvo una actuación impresionante, superando a sus compañeros de equipo de RC213V por más de cuatro décimas de segundo.