In der ersten freien Trainingssitzung des italienischen Grand-Prix-Wochenendes in Mugello übernahm Maverick Vinales, der Aprilia MotoGP-Fahrer, die Führung. Vinales hatte beim Treffen des vorherigen Wochenendes in Barcelona mit wenig Grip zu kämpfen, kämpfte mit einem Mangel an Gefühl im Vorderreifen und wurde von seinem Teamkollegen Aleix Espargaro überholt. Dennoch zeigte er eine frühe Rückkehr zur Form auf der hochgriffigen Strecke von Mugello. Seine Rundenzeit von 1m46.140s brachte ihn zwei Zehntel vor Fabio Quartararo von Yamaha. Die M1s sahen während der 45-minütigen Sitzung wettbewerbsfähig aus, insbesondere nach den Tests in Mugello Anfang dieses Monats.
Franco Morbidelli, Quartararo’s ehemaliger Teamkollege bei Yamaha, belegte den dritten Platz als bester Ducati-Fahrer. Pedro Acosta von Tech3 Gas Gas konnte trotz eines späten Sturzes in Scarperia den vierten Platz sichern. Jorge Martin von Morbidellis Pramac-Team kam auf den fünften Platz, gefolgt von Marc Marquez, seinem Rivalen um einen Platz im offiziellen Ducati-Team. Marquez, der eine ein Jahr alte Ducati für Gresini fuhr, entschied sich, während der Sitzung seine Reifen nicht zu wechseln, und beendete das Training auf dem sechsten Platz, etwas mehr als vier Zehntel hinter dem Führenden.
Pecco Bagnaia, der amtierende Ducati-Meister, fand sich in einer ähnlichen Situation wieder, da er den gleichen Reifensatz behielt und den neunten Platz belegte. Leider wurde seine beste Rundenzeit nach der Sitzung ausgeschlossen, die ihm den achten Platz gesichert hätte. Stattdessen belegte Alex Rins von Yamaha den achten Platz, gefolgt von Aleix Espargaro von Aprilia, der zwei Ausflüge in den Kies bei Kurve 1 (San Donato) hatte.
Obwohl sie den gleichen Reifensatz behielten, erzielten Alex Marquez von Gresini Ducati und Raul Fernandez von Trackhouse Aprilia anständige Ergebnisse und komplettierten die Top 11. Pol Espargaro, ein Gastfahrer von KTM, begann sein erstes MotoGP-Wochenende seit Ende 2023 und beendete es auf dem 15. Platz. Luca Marini war der bestplatzierte Honda-Fahrer auf dem 19. Platz, während der japanische Hersteller ebenfalls Tests durchführte.
