In Vorbereitung auf den Großen Preis von Italien in Mugello sicherte sich Jorge Martin, der aktuelle Führende der MotoGP-Meisterschaft, die Pole-Position. Diese Errungenschaft wurde noch bedeutender, da Marc Marquez, ein starker Konkurrent, während seiner Runde, die das Potenzial hatte, Martins Zeit zu schlagen, stürzte. Marquez setzte zunächst eine respektable Zeit, während er Pedro Acosta folgte, fand sich jedoch bei seinem zweiten Versuch in einer nachteiligen Position. Dennoch wagte er einen kühnen Überholmanöver gegen Miguel Oliveira und versuchte, Franco Morbidelli zu verfolgen, um einen Referenzpunkt für den Rest der Runde zu haben. Leider stürzte Marquez in Scarperia und beendete damit seine Chancen auf die Pole-Position. Martins ursprüngliche Rundenzeit von 1m44.504s reichte aus, um die Pole-Position zu sichern, obwohl er sich bei seinem zweiten Versuch nicht verbesserte.
Pecco Bagnaia, der amtierende Champion, konnte sich ebenfalls bei seinem zweiten Versuch nicht verbessern und wird das Rennen aufgrund einer drei Positionen umfassenden Grid-Strafe für das Behinderen von Alex Marquez während der Freitagssitzung von Platz fünf starten. Bagnaia wird jedoch trotzdem als Zweiter im Sprintrennen starten, da die Strafe nur für das volle Rennen gilt. Maverick Vinales, der für Aprilia fährt, sicherte sich mit einer engen Verfolgung von Bagnaia bei seinem ersten Versuch die drittschnellste Zeit. Obwohl er gegen Ende drohte, seine Zeit zu verbessern, gab er sich letztendlich mit einer etwas langsameren Zeit zufrieden, die ihn dennoch in die erste Reihe bringen würde.
Marc Marquez wird trotz seines Sturzes den Großen Preis von Italien von Platz drei aus starten, hinter Martin und Vinales und vor Bagnaia. Enea Bastianini, Bagnaias Teamkollege, sicherte sich den fünften Platz, während Franco Morbidelli, der bereits in Q1 den Rundenrekord gebrochen hatte, den sechsten Platz belegte. Pedro Acosta, der einzige KTM/Gas Gas RC16-Fahrer in Q2, beendete das Rennen auf dem siebten Platz. Der junge Marquez und Aleix Espargaro von Aprilia vervollständigen die dritte Reihe.
Alex Rins, der das Yamaha-Team anführt, sicherte sich die zehnte Position, gefolgt von Miguel Oliveira und Raul Fernandez von Trackhouse Aprilia. Fernandez wäre in der zweiten Reihe gewesen, wenn er seine Leistung aus Q1 wiederholt hätte. Ein Sturz des Gastfahrers Pol Espargaro führte zu gelben Flaggen, was Fabios Di Giannantonios Chancen, in Q2 aufzusteigen, beeinträchtigte. Di Giannantonio beendete das Qualifying auf dem 14. Platz.
Fabio Quartararo, der die zweite Yamaha fährt, wird von Platz 15 starten und verpasste knapp einen Platz in Q2, trotz der verbesserten Leistung von Yamaha und seines eigenen starken Renntempos. Marco Bezzecchi, Quartararos Teamkollege im VR46-Team, beendete das Qualifying auf dem 16. Platz, gefolgt von Joan Mir als dem besten Honda-Fahrer. Mir erhielt einen rechtzeitigen Windschatten von Quartararo und beendete Johann Zarcos Serie als bester Honda-Fahrer seit Zarcos Ankunft.
Jack Miller hatte eine enttäuschende Leistung und beendete das Qualifying auf dem 19. Platz auf der zweiten offiziellen KTM. Er wurde dicht gefolgt von Augusto Fernandez von Tech3 Gas Gas und Gastfahrer Espargaro, trotz des Sturzes des Letzteren.
