Enea Bastianini übernimmt die Führung in der zweiten MotoGP-Trainingseinheit in Portimão, während Marc Marquez seinen ersten Sturz der Saison erleidet. Marquez, der während der Tests nur einen Vorfall hatte und während des Rennens in Katar auf dem Motorrad blieb, stürzte am Ende der Sitzung. Dieser Sturz hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf seine Leistung, da er sich problemlos einen Platz in Q2 sicherte. Bastianini stellte die schnellste Runde in 1m38.057s auf, mehr als zwei Sekunden schneller als Marquez‘ vorherige Runde in der ersten Trainingseinheit. KTM’s Jack Miller war der nächste Konkurrent zu Bastianini, gefolgt von Marquez und Pramac’s Jorge Martin. Trotz eines frühen Sturzes belegte Millers Teamkollege Binder den fünften Platz. Marco Bezzecchi und Maverick Vinales hatten ebenfalls großartige Leistungen und belegten die Plätze sechs und sieben. Der amtierende Champion Pecco Bagnaia hatte anfangs Schwierigkeiten, sich einen Platz in den Top Ten zu sichern, konnte jedoch seine Zeit in der letzten Runde verbessern und beendete das Training auf dem achten Platz. Fabio Quartararo und Alex Rins, beide auf Yamaha, komplettierten die Top 10 und wurden die ersten Fahrer, die sich in dieser Saison direkt mit japanischen Motorrädern für Q2 qualifizierten. LCR Honda’s Takaaki Nakagami belegte den 16. Platz, während Tech3 Gas Gas‘ Pedro Acosta der schnellste Fahrer war, der die automatische Qualifikation für Q2 verpasste. Mehrere Fahrer, darunter Aleix Espargaro, Alex Marquez, Luca Marini und Franco Morbidelli, erlitten während der Sitzung Stürze. Morbidellis Sturz war besonders enttäuschend, da er den ganzen Tag über eine gute Leistung gezeigt hatte und in den Top Ten hätte sein können.